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实验概要
运用LOWRY法测定蛋白质的含量。
实验原理
Lowry法是双缩脲法和福林酚法的结合与发展,其原理是:蛋白质溶液用碱性铜溶液处理,形成铜-蛋白质的络合盐,再加入酚试剂后,除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外,还使双缩脲法中肽键、碱性铜的显色效果更强烈。因此,Lowry法的显色效果比单独使用酚试剂强烈3~15倍,为双缩脲法100倍。由于肽键显色效果增强,从而减小了因蛋白质种类引起的偏差。
Lowry法的试剂由两部分组成,试剂甲相当于双缩脲试剂(碱性铜溶液),可与蛋白质中的肽键起显色反应;试剂乙为磷钨酸和磷钼酸混合液,在碱性条件下不稳定,易被酚类化合物还原生成钼蓝和钨蓝混合物而呈蓝色反应,因此蛋白质的酪氨酸和胱氨酸等可显色,颜色深浅与蛋白质含量成正比。
主要试剂
Na2WO4•2H2O;Na2MoO4•2H2O;85% H3PO4;浓HCl;Li2SO4•H2O;溴水;酚酞指示剂;Na2CO3;NaOH;CuSO4•5H2O;酒石酸钾钠;
牛血清白蛋白:用水配成250mg/ml。
主要设备
试管若干;刻度吸管0.5ml,1ml,10ml;定量加样器;圆底烧瓶;冷凝管一套(带橡胶管);微量滴定管;小烧杯;微量进样器50μl;分光光度计。
实验材料
可溶性蛋白质
实验步骤
1. 酚试剂的制备
(1)取Na2WO4•2H2O 100g,Na2MoO4•2H2O 25g 及蒸馏水700ml于1500ml的圆底烧瓶中,之后加入85% H3PO4 50ml,浓HCl 100ml。安上回流冷却装置(使用磨口接头。用软木塞或橡皮塞时,必须用锡泊包起来),使其慢慢沸腾10h。冷却后加入Li2SO4•H2O 150g,水50ml,浓HCl 100ml安上回流冷却装置,开口加热煮沸15min,以逐出过量的溴。冷却后稀释至100ml,并过滤入棕色瓶中,密闭于冰箱中保存。
使用时用标准NaOH溶液滴定,以酚酞为指示剂。滴定终点由蓝变灰。滴定后算出酸浓度,用时适量稀释,使后浓度为1mol/L H+,此为Folin-酚试剂乙液。
(2)先配制①4% Na2CO3溶液;②0.2mol/L NaOH溶液;③1% CuSO4溶液;④2%酒后石酸钾钠溶液;使用①与②等体积混合配成Na2CO3-NaOH溶液;将③与④等体积混合配成硫酸铜一酒石酸钾钠溶液。然后将这两个溶液按50︰1混合;配成Folin-酚试剂甲液。此试剂只能用一天。
2. 标准曲线的绘制
(1)取7只试管编号,分别加0ml,0.1ml,0.2ml,0.4ml,O.6ml,0.8ml,1.0ml标准蛋白质溶液,用水补到1ml,便成为每管含蛋白为0mg,25mg,50mg,100mg,150mg,200mg,250mg标准系列(必要时可做重复)。
(2)加5ml试剂甲,混匀,于30℃放置10min。
(3)喷射加入0.5ml试剂乙,立即振荡混匀,在30℃下保温30min。
(4)准确到30分后,以不加标准蛋白的管为空白,在500nm波长下比色测定吸光度值。
(5)以蛋白浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线。
3. 样品测定
(1)取50μl样液加入试管中,(样液提取一般按0.1g鲜样/ml比例,提取方法见各酶活测定)加蒸馏水补至1ml,然后重复步骤2的(2),(3),(4),以空白为参比,测吸光度值。
(2)根据吸光度值,查标准曲线求得蛋白质含量。
4. 结果计算
蛋白质含量(mg/g鲜重)= (C*V/a)/W 式中 C-查标准曲线得样品测定管中蛋白质含量(mg);
V-提取液总量(ml);
a-测定时取样液量(ml);
W-取样量(g)。
注意事项
1. Folin试剂乙只在酸性条件稳定,故当其加到碱性的铜-蛋白质溶液中时,必须立即混匀,以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏,还原反应即能发生。
2. 为了保证反应进行完全,反应在25~30℃水浴中进行,反应30min后准时比色。
3. 还原物质干扰本实验。
考马斯亮蓝法和LOWRY法两种方法均是灵敏度为微克的高灵敏度定量测定蛋白质方法,者稳定,后者简便;二者均优于现有的其它方法。
二者的缺点是:
1. Lowry法受植物体内存在的酚类物质干扰;
2. 考马斯亮蓝法在蛋白质含量很高时线性关系稍偏低,且不同蛋白质与色素结合状况有差异。
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