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【PCR检测】病原微生物检测操作方法
阅读次数:189 发布时间:2024/12/11 10:25:07
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多聚酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是一种模拟天然DNA复制过程,在体外扩增特异性DNA(或RNA)片段的新技术。本实验是将待检双链DNA经94℃高温变性成单链作模板,然后加入一对人工合成的寡核苷酸引物,引物分别与待扩增DNA片段的两端互补,经55℃低温退火,引物与模板互补结合。在72℃条件下,结合于模板上的引物在DNA聚合酶的催化下,利用反应体系中的4种dNTP为原料,按碱基互补配对的方式延伸合成两条新的DNA链。经过20-30个周期后,特异的目的DNA可扩增百万倍以上。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后即可观察到特异的扩增条带。
 
PCR方法操作简便,灵敏度高,可检测出少至0.1pg的目的DNA。目已广泛应用于多种病原微生物及寄生虫的检测。
 
【材料】
 
1.无菌双蒸水、石蜡油、溴化乙锭
 
2.10×PCR反应缓冲液
 
3.25mmol dNTP混合液
 
4.引物1,引物2各50pmol/u1
 
5.模板DNA
 
6.5U/ul Taq DNA聚合酶
 
【仪器】
 
1.PCR扩增仪
 
2.电泳仪
 
3.紫外线分析仪
 
【方法】
 
1.在0.5m1EP管中,加入以下成分:
 
10×PCR反应缓冲液5u1
 
引物1 2ul
 
引物1 2ul
 
模板DNA 10u1
 
dNTP混合液4ul
 
Taq DNA聚合酶1ul
 
无菌双蒸水加至50ul
 
混匀,加50 ul石蜡油,防止样品水分蒸发。
 
2.将反应管置于PCR仪中,94℃变性4min。然后按94℃变性30s→55℃退火30s→72℃延伸1min,循环35次后,72℃延伸10 min。
 
3.反应完成后,取l0ul PCR扩增液,加至2%琼脂糖凝胶中进行电泳,电压100V,电泳30~60min后,置紫外线分析仪下观查扩增结果。
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